實時熒光定量PCR（TaqMan探針法）

1. 原理

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)結(jié)合了實時定量PCR儀、實時熒光定量試劑、通用電腦和自動分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。

熒光探針技術(shù)是根據(jù)標(biāo)記基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）原理而實現(xiàn)的。當(dāng)某個熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜與另一個熒光基團(tuán)的吸收光譜重疊，且2個基團(tuán)距離足夠近時，能量可以從短波長(高能量)的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，相當(dāng)于短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光被屏蔽，這個過程稱為FRET。

實時熒光定量PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。理想的擴(kuò)增曲線應(yīng)為J型，符合2^N方程(其中N為PCR的循環(huán)次數(shù))，但實際上擴(kuò)增曲線為S型。在PCR反應(yīng)早期，不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在指數(shù)期的某一點上檢測PCR產(chǎn)物的量，并由此推斷起始模板含量。

2. 類型

    實時熒光定量PCR技術(shù)的常用機(jī)制包括熒光染料檢測和水解探針檢測。

3. TaqMan探針

PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

常規(guī)TaqMan探針的5’端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM（6-羧基熒光素），3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）。該探針在PCR過程中不能被延伸。根據(jù)FRET原理，當(dāng)探針保持完整時，3’端淬滅基團(tuán)抑制5’端發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。在PCR的退火期，探針與模板發(fā)生特異性雜交，延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，當(dāng)?shù)竭_(dá)探針處，Taq酶發(fā)揮5’-3’外切活性，繼而發(fā)生置換。切斷探針后，F(xiàn)AM與TAMRA分離，熒光信號得到釋放。這時熒光探測系統(tǒng)就能檢測到光密度有所增加。模板每復(fù)制1次，就有1個探針被切斷，并有1個熒光信號被釋放。

由于理論上被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)和PCR產(chǎn)物數(shù)是一對一的關(guān)系，且光密度同被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)也呈正比關(guān)系，因此該技術(shù)可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。但TaqMan也存在一定不足，主要表現(xiàn)在：①由于采用熒光和淬滅基團(tuán)雙末端標(biāo)記，因此淬滅難以徹底，本底較高。②報告基團(tuán)的水解利用的是Taq酶的5’-3’外切活性，因此定量時容易受酶活性影響。③探針標(biāo)記成本較高，不便普及應(yīng)用。

另外還有TaqMan MGB（minor groove binder）探針、分子信標(biāo)、雙雜交探針、復(fù)合探針等特異性檢測技術(shù)。

4. 實驗步驟

（1）樣品RNA的提取

    取新鮮的組織或細(xì)胞（如果不能立即開展實驗，應(yīng)將樣品置于-80℃冰箱保存），加入適量的Trizol裂解液，使組織或細(xì)胞中的內(nèi)容物釋放出來。采用有機(jī)溶劑氯仿/異丙醇抽提，提取組織或細(xì)胞中的總RNA。

（2）RNA濃度及純度檢測

    采用瓊脂糖凝膠電泳定性檢測提取的總RNA的濃度及純度，并且使用Nanodrop 2000測定RNA濃度和純度。

（3）cDNA第一條鏈的合成

按照說明書的要求在反應(yīng)體系中加入0.5~1 ug的總RNA、RT prime、dNTP Mix、RNase Inhibitor 、RT Enzyme、RT Buffer，用ddH₂O補(bǔ)足體積。保證每個樣品加入的總RNA量相同。然后置于PCR儀中擴(kuò)增合成cDNA第一條鏈。

（4）待測樣品的管家基因及待測基因?qū)崟r熒光定量PCR

實驗開始時根據(jù)實驗要求設(shè)計并合成內(nèi)參基因、待測基因引物和特異性的熒光探針。按照說明書要求在反應(yīng)體系中加入SYBR Green Mix、cDNA模版、內(nèi)參基因或待測基因上下游引物，特異熒光探針，用ddH₂O補(bǔ)足體積。然后置于熒光定量PCR儀中，設(shè)置好參數(shù)，進(jìn)行擴(kuò)增。

（5）數(shù)據(jù)處理

觀察擴(kuò)增曲線和溶解曲線，根據(jù)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，計算樣品Ct值。

5. PCR疑難解答

當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時，首先檢查以下幾方面并遵照執(zhí)行：

（1）將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼；

（2）當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動”開始循環(huán)時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱； 

（3）不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡；

（4）對于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。

沒有擴(kuò)增產(chǎn)物：

（1）在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；

（2）泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+； 

（3）檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度；

（4）檢查模板和引物的用量；

（5）增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。

 注意事項：

1.樣本要求：組織、細(xì)胞、血液、體液等；

2.DNA樣本-20℃保存，RNA樣本-80℃保存；干冰運輸。